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甲基叔丁基醚对细胞周期及细胞凋亡的影响 |
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并不清楚。已知化学物质致癌与细胞周期改变，细胞增殖和凋亡之间的平衡失调有着密切关系［2］。目前还没有关于MTBE影响细胞周期和细胞凋亡的报道。
材料与方法
MTBE由上海炼油厂提供，纯度为98.8%。
1．MTBE的细胞毒性及对细胞生长的影响：将Hela细胞按每孔104/100 μl接种于96孔细胞培养板中，培养基为含10%小牛血清的RPMI 1640 （Sigma）。接种细胞的同时，加入不同浓度的MTBE，每浓度组作8个平行样。16 h后，各孔分别加入5 μl MTT［3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-dephenyl tetrazolium bromide, Sigma］，终浓度为250 μg/ml。继续培养4 h后，弃培养基，每孔加入50 μl DMSO，充分混合，以溶解蓝黑色结晶。室温放置数分钟至所有结晶溶解后，测定吸光度（A值，波长为570 nm, Bio-RAD Model 450 Microplate Reader）。
2．MTBE对细胞周期的影响：
（1）细胞处理：选用NIH/3T3细胞，按5×105密度接种于60 mm培养瓶中。培养基为5 ml含10 %小牛血清的DMEM (Sigma)。接种24 h后，加入不同浓度的MTBE，染毒时间为24 h。染毒结束后，除阴性对照及中浓度组（10 μl/5 ml）细胞于新鲜培养基中继续培养至染毒后0、2、4 d外，其余各组细胞经胰酶消化，预冷PBS漂洗，置于柠檬酸缓冲液1 h以上，调细胞浓度至1×106/ml。PI-碘化丙锭作用后，于流式细胞仪上作DNA细胞周期分析。
（2）流式细胞仪：为美国Becton Dickinson公司FAC Star PLUS产品。采用氩离子激光器Innova 90-5，激光功率为200 mW，激光波长为488 nm。数据处理采用B.D公司Cellfit软件。
3．MTBE对Hela细胞生长的影响：Hela细胞是一种上皮来源的肿瘤细胞，肿瘤坏死因子（TNF）α和放线菌酮联合作用可明显诱导其凋亡，该模型已被广泛应用于细胞凋亡的测定［3］。我们采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记（TUNEL）法也证实TNFα和放线菌酮可明显诱导Hela细胞凋亡。本实验中，将Hela细胞接种于96细胞培养板中，接种密度为每孔104/100 μl。16 h后，每培养孔中分别加入10 ng/ml的TNF和10 μg/ml的放线菌酮，以诱导细胞凋亡。同时加入不同浓度的MTBE，每浓度组作8个平等样。16 h后，弃培养基，PBS漂洗，每孔加入50 μl的结晶紫染色细胞。10 min后，蒸馏水漂洗，加入乙酸100 μl，测定吸光度（A值，波长为540 nm，Bio-RAD Model 450 Microplate Reader）。
结果
1．MTBE的细胞毒性及对细胞生长的影响：本试验中，对照组吸光度值A570为0.230±0.009,各剂量组（浓度分别为1,2,4 μl/ml,1 μl/ml=0.747 mg/ml）的A570分别为0.221±0.007,0.229±0.007,0.233±0.006，与阴性对照相比差异无显著性意义（P>0.05, Dunnett t检验）。表明各组中存活细胞数量无明显差别，即MTBE无明显的细胞毒性，对细胞的生长、贴壁、增殖等均无明显影响。
2．MTBE对细胞周期的影响：NIH/3T3细胞经MTBE染毒后，细胞周期发生了改变。表现为S期细胞减少，而处于G2+M期的细胞增多；且随剂量的增高，上述改变有加剧的趋势。提示MTBE可能具有影响NIH/3T3细胞周期的作用，使细胞提前进入分裂期。这种作用持续存在于染毒后48 h的细胞中。到染毒后96 h，细胞周期基本恢复正常(表1)。
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