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染色体微切割 微分离 微克隆技术及其研究进展 |
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戢福云 余其兴
摘 要：自1981年染色体微切割及微克隆技术创建以来，该技术已广泛应用于人类及动植物遗传学、医学、进化学等研究领域，主要包括构建特定染色体或染色体区域的DNA文库、制备染色体描绘探针池以研究染色体重排和染色体进化等。本文对该技术的产生、发展及某些研究进展作一综述。
关键词：染色体；微切割；微分离；微克隆
中图分类号：Q8134 文献标识码：A 文章编号：0253－9772(2000)04－0258－04
Advances in Study of Chromosome Microdissection and
Microcloning Technique
JI Fu-yun YU Qi-xing
（Department of Genetics,College of Life Science,Wuhan University,Wuhan,430072，China）
Abstract: Since chromosome microdissection and microcloning technique was developed in 1981,it has been wide ly used in genetics,medicine,evolution and other fields,mainly in establishing chromosome or chromosone specific region DNA libraries,preparing chromosome painting probe pools to study chromosome rearrangement and evolution.In the paper,the development and research progress of the technique are discussed.
Key words:chromosome；microdissection；microisolation；microcloning
随着高度多态的DNA遗传标记的丰富和应用，人类及许多高等动植物的基因图的研究也取得了长足进步。但基因图中遗传标记分布不均匀，有的染色体区域遗传标记的密度尚需进一步提高，有的染色体区域需要新的标记去填充以建立高精度基因图。这就需要采用新方法去发现和利用染色体特异的DNA文库和新的标记。1981年Scaleghe等首次应用染色体微切割方法成功地分离并克隆了果蝇多线X染色体的特定区域［1］。此后，染色体微切割和微克隆方法广泛应用于构建鼠［2］、人［3］染色体特定区域的DNA文库及探针池。为获得染色体特异的遗传标记提供一个新的方法，近年来，该方法也广泛应用于医学、进化研究等领域［4，5］，为探索人类及高等动植物基因组的奥秘开辟一条新的途径和提供丰富的信息资源。
1 染色体微切割、微分离、微克隆技术流程
染色体微切割、微分离及微克隆技术主要包括染色体标本的制备、微切割染色体、染色体DNA的克隆和鉴定等。
1.1 制备染色体标本
染色体标本的制备与常规制片的差别在于固定液的组成成分比例和固定时间。常规制片时固定液为3:1的甲醇：冰乙酸，而制备微切割染色体标本时为9:1、5:1和3:1的甲醇:冰乙酸梯度固定液，并且，固定时间相对较短。其目的是防止冰乙酸损伤DNA结构而影响微克隆效率［6］。
1.2 微切割及分离染色体
染色体微切割最初是在倒置显微镜下用带有尖端直径不超过05μm玻璃针的显微操作仪上进行。具体如下：在倒置显微镜下于160×倍视野中用玻璃微针切割并分离染色体，然后把粘附有染色体的针尖连同染色体碎于EP管中。在粘附有染色体片段的玻璃微针移开玻片前，用1～2滴乙醇冲洗针尖，其目的是破坏表面张力而使染色体紧紧附着于针尖，防止染色体片段丢失［1］。
1.3 染色体DNA的微克隆
首先将分离出的多个同一目的染色体片段进行抽提去蛋白质及DNA纯化、酶切，然后加入同一限制性内切酶切割的载体及连接酶，连接后再转化一定的宿主菌，以建立染色体DNA文库。在PCR介导的微克隆技术发展之前，主要采用这种酶切直接克隆法。
1.4 微克隆的鉴定
所建立的DNA文库的特异性一般采用Southern杂交、原位杂交和特[1] [2] 下一页
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