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大鼠双后肢高能爆炸伤后远位器官的研究 |
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李 巍 蔡文琴
(第三军医大学组织学胚胎学教研室，重庆 400038)
摘 要 为了探讨大鼠双后肢高能爆炸伤后，远位器官(脑、小肠、膀胱)的形态学改变和这些器官中的生长抑素(SOM)和促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)的变化，用原位杂交组织化学、免疫组织化学、常规光、电镜技术和图像分析等方法作为研究手段，结果显示：1. 大鼠双后肢炸伤后，超微结构有明显变化，主要表现为小肠、膀胱中的血管内皮皱缩、胞质内吞饮小泡增多及脑内神经毡水肿和轴突退行性变。2. 炸伤后，远位器官中SOM及SOMmRNA和CRFmRNA均有一过性的、应激性的变化。3.炸伤后，远位器官中不仅神经内分泌细胞SOM和CRF表达增强，而且在小肠和膀胱结缔组织中，也出现了高表达的SOMmRNA和CRFmRNA信号细胞，性质待定。本研究提示：高能爆炸伤可致远位器官损伤，SOM和CRF参与了大鼠炸伤后的创伤应激反应和远达效应的发生，为高能爆炸伤的发生机制和战伤研究提供了基础资料。
关键词 高能爆炸伤 远位器官 生长抑素 促肾上腺皮质激素释放因子 原位杂交 免疫组织化学
随着现代轻武器的发展，出现了许多杀伤力强、速度快、能量传递率高的高速(900m／s以上)破片武器、小型武器等称为高速投射物［1］。这些高速投射物除造成严重的局部损伤外，还会引起远位器官损伤，严重影响伤情转归［2］。因而，高速投射物远达效应，已成为当前火器伤研究的前沿课题。神经内分泌因子在远达效应中的作用，也越来越受到人们的关注，损伤后这些因子的变化，国内外已有少数文献报道［3，4］。但是否会引起神经内分泌因子的前体mRNA的变化，尚未见文献报道。因此，本研究采用免疫组织化学、原位杂交组织化学、常规光、电镜观察和图像分析等技术，研究了大鼠双后肢高能爆炸伤后，远位器官(脑、小肠、膀胱)在常规光、电镜下的形态学变化及其中的生长抑素(SOM)及其mRNA和促肾上腺皮质激素释放因子(corticotropin releasing factor CRF) mRNA的变化，以期为远达效应的发生机制提供基础资料。
材料和方法
健康成年雄性Wistar大鼠100只，随机分成5组，即对照组(16只)、伤后30min、1h、6h、及12h组(致伤组，21只／组)。动物麻醉后，将小型爆炸器(含300mgTNT)捆在大鼠双后肢之间，引爆后，选择双后肢粉碎性断离而腹壁未破者为研究对象(成功率为90%左右)。根据实验方法的不同，以两种方式取材：
1. 光镜、电镜部分
动物麻醉后，直接取膀胱、小肠、脑(以视交叉冠状平面为界向后保留0.5cm)，光镜组组织放入Bouin液中固定24h左右。石蜡切片(厚5μm)，HE染色，光镜观察。电镜组则将组织修成1mm左右的方块(脑组织取大脑皮层和下丘脑)，放入3%戊二醛溶液中4℃固定24h左右。超薄切片(厚50～70nm)，铀、铅染色，透射电镜观察。
2. 免疫组织化学和原位杂交组织化学部分
动物麻醉后，用4%多聚甲醛加0.3%饱和苦味酸混合液(pH7.2～7.4)行主动脉灌注，取脑、小肠和膀胱置于相同固定液中8～12h(4℃)，再用含20%蔗糖上述固定液浸泡至组织块下沉后冰冻切片(厚30μm)。(1) 免疫组织化学染色：用Sternberger PAP法，显示SOM-imminoreactive(SOM-IR)细胞和纤维。主要染色程序为：冰冻切片经兔SOM抗血清(1∶4 000，Peninsula Lab. USA),4℃过夜；羊抗兔IgG(1∶50，第二军医大学产品)，37℃，45min；兔PAP复合物(1∶200，上海第二医科大学产品)37℃，1h；DAB-H2O2液显色。对照实验用0.01 mol/L PBS加1%牛血清白蛋白代替一抗，其余步骤同上。(2) 原位杂交组织化学：用Behringer Mannheim公司的Dig-RNA标记盒，合成反义SOMcRNA探针和CRFcRNA探针。主要程序：冰冻切片经蛋白酶K(2mg/L)37℃孵育20min；分别入含地高辛标记的SOM-cRNA探针和CRF-cRNA探针(0.5 mg/L)的杂交液中杂交，43℃，12～16h；碱性磷酸酶标记的羊抗地高辛抗体Fab段(1∶1 000 Boehringer Mannheim公司)，37℃，2h；硝基四氮唑蓝(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(BCIP)混合液在室温下显色3～5h；光镜观察。对照实验用未加探针的杂交液杂交，其余步骤相同。分别将各组、各组织的原位杂交切片[1] [2] 下一页
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