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用甲基纤维素半固体培养基筛选杂交瘤细胞 |
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苏玉虹 刘 玲
中国图书分类号 R392-33
制备单克隆抗体一个必不可少的步骤就是使融合后的细胞进行单克隆培养。融合细胞的克隆化方法主要采用有限稀释法［见：徐新来.细胞培养在杂交瘤技术中的应用.见：鄂 征主编.组 织培养和分子细胞学技术.北京：北京出版社，1995：207～214］。由于需要反复克隆再克隆，细胞培养的工作量大，操作繁琐，克隆效率低。我们采用甲基纤维素制成半固体培养基可以克服以往方法上的局限性，直接进行克隆化的培养，提高了工作效率。
1 材料与方法
1.1 甲基纤维素半固体培养基的制备 称取2 g甲基纤维素（Sigma公司产品）溶于50 ml三蒸水中，4℃冰箱搅拌过夜，高压消毒，无菌条件下加入50 ml，2×IMDM1640（GIBCO产品）无血清培养液，磁力搅拌24 h。
1.2 细胞融合后培养 将小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0和用人乳头瘤病毒（HPV）16型E6蛋白免疫的Balb/c小鼠的脾细胞在PEG4000介导下进行常规细胞融合［见：Goding J W.Antibody production by hybridomas. J Immunol Meth,1980;39:285］。融合后细胞沉淀加入3 ml IMDM1640，10 ml胎牛血清(Sigma产品)，50×HAT 1 ml，再加入饲养细胞悬液2 ml，混匀。加入上述制备的甲基纤维素半固体培养基，混匀后倒入直径3.5 cm的平皿中，每个平皿2 ml。37℃，5％CO2 孵箱培养1 w。
1.3 克隆的观察与挑选 肉眼可见平皿的培养基表面有白色斑点，显微镜下即为细胞克隆团。无菌条件下将平皿中分散的、单个的细胞团吸起放入96孔板培养液中，继续培养。待细胞长满96孔板底部时进行ELISA检测，阳性孔细胞进行扩增培养和再检测。
2 结果
细胞融合后7 d可见半固体培养基表面出现许多克隆团（见图1）。我们共挑选了1 032个独立、分散的细胞克隆进行液体培养。阳性克隆为73株。扩增培养并反复检测后，有24株稳定分泌抗HPV16 E6蛋白的单克隆抗体，克隆率为2.32％。
图1 在甲基纤维素半固体培养基中生长的杂交瘤细胞
Fig.1 Hybrid colony in semi-solid medium containing methlcellulose
3 讨论
甲基纤维素半固体培养基克隆化培养杂交瘤细胞比有限稀释法要容易许多。首先是融合细胞彼此分离，呈集落生长，相互不产生干扰、不混杂。一步即可完成单克隆的分离工作。其次是所获克隆数明显增多。我们挑选1 032株单细胞克隆，相当于130个96孔板所产生的量。由于是一步即可完成克隆化培养，所以工作量大大减少，实验周期显著缩短。根据以上这些，我们认为甲基纤维素半固体培养法在单抗制备中有很高的实用价值。
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