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莱姆病螺旋体中国分离株外膜蛋白C基因的克隆与序列分析

山地区长角血蜱分离株,BJ-9011为一莱姆病患者血液分离株[3,4]。均由本室保存培养,暗视野显微镜下观察其生长情况,离心收集菌体,按常规方法制备基因组DNA。
  2.质粒和菌种:宿主菌大肠杆菌DH5α和JM101株由病毒基因工程国家重点实验室提供。pGEM-3ZF(+)质粒购自美国Promega公司。
  3.主要试剂:EcoRⅠ和BamHⅠ等内切酶为美国New England Biolabs 公司产品,T4 DNA连接酶、蛋白酶K、Taq DNA聚合酶、dNTP、X-gal、异丙基硫代β-D半乳糖苷(IPTG)等为美国Promega公司产品,其它主要生化试剂为美国Promega公司、Sigma公司产品或国产分析纯。
  4.引物设计:PCR引物参照文献[5]的PKo株OspC基因序列自行设计,上游引物:5′-GCGAATTCATGTGTAATAATTCAGGGA 3′,下游引物:5′-GCGGATCCTTAAGGTTTTTTTGGA 3′,由中国科学院微生物学研究所合成。上下游引物分别含EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点,扩增片段为除信号肽外的OspC基因,长度约为579 bp。
  5.2株螺旋体OspC基因PCR扩增及重组质粒的构建:参照文献[6]分别以2株螺旋体基因组DNA为模板进行PCR,用透析袋电洗脱法回收PCR产物,用EcoRⅠ和 BamHⅠ双酶切,同时将质粒pGEM-3ZF(+)以同样酶进行双酶切,回收后用T4 DNA 连接酶连接,转化大肠杆菌JM101,初步经蓝/白斑筛选阳性的克隆用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切鉴定。
  6.DNA 序列测定:将酶切证实的重组质粒转化大肠杆菌DH5α。采用Sanger双脱氧末端终止法和pGEM-3ZF(+)克隆-模板系统,由军事医学科学院生物工程研究所在美国ABI产373A型自动测序仪上进行,同一片段进行正反两方向测序。

结  果

  一、螺旋体OspC基因扩增及重组质粒鉴定
  设计引物对2株国内螺旋体均能扩增出580 bp左右的扩增带,插入pGEM-3ZF(+)质粒后均能用EcoRⅠ和BamHⅠ切下与扩增带相同大小的片段,且重组质粒应用PCR方法均能扩增出580 bp左右的扩增带(图1)。




M.λDNA/EcoRI+HindⅢ; 1.BT01-PCR;2.BJ-9011-PCR;3.pGEM-3ZF
  (+)BT01/EcoRI+HindⅢ; 4. pGEM-3ZF(+)-BJ-9011/EcoRI
  +HindⅢ;5.pGEM-3ZF(+)/EcoRI+HindⅢ

图1 2株莱姆病螺旋体OspC-PCR与重组质粒的酶切鉴定

  二、2株螺旋体OspC基因序列核苷酸、氨基酸分析及其与国外株同源性比较
  经序列测定,除信号肽序列下,BT01株OspC基因为579 bp,编码193氨基酸,核苷酸同源性与Pko最大,为86%,与Pko株氨基酸同源性为83%,与B31株为86%。BJ-9011株OspC基因为576 bp,编码192氨基酸,与B31株核苷酸同源性及氨基酸同源性皆为99%,其序列中只有2个碱基变异,一个位于第147 bp处,读码框架为TCC (B31为TCT),编码丝氨酸(S)与 B31株一致。另一个位于第443 bp,读码框架为ATT,编码异亮氨酸(I),而B31为ACT,编码苏氨酸(T)。2株螺旋体之间核苷酸同源性为83%,氨基酸同源性为86%(图2,3)。




图2 克隆的莱姆病螺旋体中国株BJ-9011OspC基因
  部分核苷酸序列分析




图3 克隆的莱姆病螺旋体中国株BT01 OspC基因

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