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内源性一氧化氮在大鼠应激性胃粘膜损伤中的作用

张在兴 祝学光 才文彦 黎家庆

  作者观察了内源性一氧化氮(NO)在大鼠冷束缚应激性胃粘膜损伤中的作用,并以定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测应激大鼠胃粘膜NO合酶(NOS)mRNA的表达变化。
  一、材料和方法
  1.内源性NO在大鼠应激性胃粘膜损伤中的作用:雄性Wistar大鼠,体重150~200g,购自北京医科大学实验动物中心。实验前动物禁食48小时,自由饮用含8%葡萄糖、0.2% NaCl(w/v)的水溶液。参照文献[1]的方法制备大鼠冷束缚应激性胃粘膜损伤模型。动物分为3组(每组7只):对照组(2 ml生理盐水);L-硝基精氨酸(L-NNA)组(L-NNA 12.5 mg/kg,溶于2 ml生理盐水);L-NNA+L-精氨酸(L-arg)组(L-NNA 12.5 mg/kg与L-arg 500 mg/kg共同溶于2 ml生理盐水)。以上药物均于应激前10分钟双侧腹股沟皮下注射,每侧1 ml。L-NNA和L-arg均为美国Sigma公司产品。应激结束后结扎胃贲门及幽门,向胃腔内注入10%甲醛溶液10 ml,并置入同样浓度的甲醛溶液中固定,30分钟后沿胃大弯剪开,观察粘膜损伤情况。损伤表现为局限于胃腺的点状或索条状糜烂伴出血。将每只大鼠全胃各病灶长度之和作为损伤指数,以mm表示;每5个点状出血灶相当于1 mm长病灶;若病灶宽于2 mm,其长度乘以2。
  2.冷束缚应激大鼠胃粘膜NOS mRNA的表达变化:分为正常组(6只)和应激组(7只)。实验结束、处死动物,每只大鼠剪取胃粘膜组织50~100 mg,按TRIzol(总RNA提取试剂,美国GIBCO公司)说明书提取组织总RNA。参照操作手册合成cDNA。脑型NOS(bNOS)
引物由美国路易斯安纳州州立大学医学中心才新博士惠赠,其序列上游为:5′-GATGACGTCAACATCGAGA AGCCGAAC-3′,下游:5′-TGACACCCAGAGCAG TGTTCCTCTCCT-3′,扩增片段长400 bp。内对照β-actin引物根据文献的基因序列自行设计,上游:5′-TGGGACGATATGGAGAAGAT-3′,下游:5′-ATTGCCGATAGTGATGACCT3′,扩增片段长521 bp。25 μl PCR反应体积中含逆转录混合物50 ng,10 mmol/L dNTP混合物2 μl,10 μmol/L两对引物各0.5 μl,Taq DNA聚合酶0.5U,25 mmol/L MgCl2 3.0 μl。94℃变性5分钟后,按94℃变性1分钟,55℃退火2分钟,72℃延伸3分钟,扩增35个循环,最后72℃延伸10分钟。PCR产物定量取10 μl扩增样品,经1.5%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,紫外灯下观察并照相(附图)。用薄层扫描仪扫描底片上PCR产物带,计算条带的积分吸光度(A)值,用bNOS扩增产物与β-actin扩增产物A值的比值表示每个样本bNOS的表达水平。




附图 PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果

  3.统计学处理:数据以表示,组间差异显著性采用双侧t检验法。
  二、结果
  1.阻断内源性NO对应激性胃粘膜损伤的影响:以L-NNA阻断内源性NO生成后,胃粘膜损伤明显加重,损伤指数为8.9±1.1 mm,对照组为5.0±1.1 mm,P<0.05;L-NNA+L-arg组,胃粘膜损伤明显减轻,损伤指数下降为4.7±1.2 mm,与对照组比较差异无显著意义。
  2.应激大鼠胃粘膜bNOS mRNA表达变化:应激组大鼠胃粘膜bNOS mRNA表达较之正常组明显降低,bNOS与β-actin的A值之比两组分别为0.62±0.08和1.26±0.28(P<0.05)。
  三、讨论
  本实验证明,以L-NNA阻断内源性NO的生成,可明显加重冷束缚应激导致的胃粘膜损伤;在应用L-NNA的同时提供大剂量NO供体,则逆转L-NNA的作用。证明内源性NO对于冷束缚应激造成的胃粘膜损伤具有保护作用。胃粘膜组织有高水平的cNOS。cNOS又有内皮型NOS(eNOS)和bNOS)两种,胃粘膜以表达bNOS为主[2]。本实验证明,正常大鼠胃粘膜组织有较高水平的bNOS mRNA表达

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