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人乳腺浸润性导管癌端粒酶活性的检测 |
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腺手术切除者。经病理诊断其中61例为乳腺浸润性导管癌(Ⅰ级3例，Ⅱ级22例，Ⅲ级13例，不清楚23例)，5例乳腺囊腺病，9例乳腺纤维腺瘤。
二、方法
1.组织提取液制备：每例冻存乳腺组织40～100 mg，用Kim等［2］所述方法制备组织提取液。提取液蛋白浓度经测定（DC，蛋白测试盒来自美国BIO-RAD 公司）后，稀释1 μg蛋白/ml，分装存于-80℃。
2.端粒酶活性测定：用端粒酶重复扩增(TRAP)法，TRAP-酶TM来自美国Oncor Inc。12.5 μl反应体系中含有0.5 μl组织提取液。30℃温浴20分钟后，进行聚合酶链反应(PCR)循环，其产物经12.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳后，放射自显影。每个样品提取液做3个不同稀释度，即：1×(1 μg蛋白/μl)，10×(0.1 μg蛋白/μl)，100×(0.01 μg蛋白/μl)。以裂解缓冲液代替提取液以确定样品无污染，提取液用RNA酶37℃20分钟处理后做阴性对照。阳性对照由测定盒提供的阳性样品提取液。参照Hiyama等［3］半定量方法并略加修改，用于判定端粒酶活性的程度：强：为10倍(0.1 μg蛋白)或100倍(0.01 μg蛋白)稀释提取液仍能检测到酶活性；弱：提取液在1 μg蛋白量或更高蛋白浓度时方能检测到酶活性；阴性：任何蛋白浓度均检测不到酶活性。
3.统计学处理：采用t检验。
结 果
61例乳腺浸润性导管癌中49例(80%)显示端粒酶活性(附图)，其中Ⅰ级2例，Ⅱ级18例，Ⅲ级10例，分级不清楚19例。端粒酶活性与乳腺浸润性导管癌的分级无相关性。端粒酶活性与肿瘤大小亦无相关性(P>0.05)。小于2 cm的乳腺癌，端粒酶活性的检出率高达77%(14/18)，大于2 cm的乳腺癌，检出率为80%(32/40)。在22例乳腺浸润性导管癌伴有腋窝淋巴结转移者中，18例显示端粒酶活性(82%)；20例无腋窝淋巴结转移者中14例显示端粒酶活性(70%)，两者比较差异无显著意义(P>0.05)。乳腺癌组织端粒酶活性与雌激素受体
a、b、c.提取液稀释度，分别为1 μg蛋白、0.1 μg蛋白
及0.01 μg蛋白；d.RNA酶处理；1～4.分别为病例序号
附图 TRAP法检测浸润性导管癌端粒酶活性(ER)、孕激素受体(PR)表达无相关性。5例乳腺囊腺病患者均未显示端粒酶活性，而9例乳腺腺瘤患者有4例显示端粒酶弱活性。
讨 论
自1994年Kim等［2］建立了TRAP方法以来，仅仅几年时间，人们已对人多种肿瘤及正常组织端粒酶活性进行了检测。大多数报道指出除生殖细胞和部分造血干细胞外，端粒酶活性主要特异性的出现于恶性肿瘤组织内，而在正常体细胞内未见［1］。本研究比较了乳腺良性病变和浸润性导管癌端粒酶活性，有80%乳腺浸润性导管癌患者显示端粒酶活性，并未发现乳腺浸润性导管癌端粒酶活性与肿瘤的分级、大小、淋巴结转移甚至肿瘤组织ER、PR状态相关，可能是与端粒酶活性在很早期的乳腺癌组织中就已经存在或获得有关系。
我们还观察到某些病例用标准的1 μg蛋白提取液检测时端粒酶显示阴性，而把样品做10倍或100倍稀释后则显示阳性。提示，一些样品组织内可能存在端粒酶或是Taq酶抑制剂，当样品被稀释后大大降低其抑制效应。
在乳腺良性病变组织中，5例乳腺囊腺病患者的端粒酶活性均显示阴性，9例乳腺腺瘤患者中有4例显示弱阳性。乳腺腺瘤和导管内乳头状瘤长期发展均有癌变可能，乳腺腺瘤组织内端粒酶活性的意义及是否伴有端粒酶活性的乳腺腺瘤更易发展成乳腺癌尚需进一步研究。
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