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内毒素诱导的肝细胞及枯否细胞凋亡与肝脏损伤的关系 |
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of liver enzymes (ALT, LDH), responsible for hepacyte damage, rose significantly, but the process was behind of apoptosis, and TNFα antibody couldn′t block it. Conclusion TNFα mediates LPS-induced apoptosis in KC and HC, and the apoptosis precedes cellular damage. Massive apoptosis of KC may lead to the decrease of clearance of LPS, thereby exacerbating septic shock, hepatocyte damage and apoptosis.
【Key words】 Apoptosis Kupffer cells Hepatocyte Tumor Necrosis factor
(Natl Med J China, 1998, 78：423-425)
很多研究已发现，枯否细胞受内毒素激活可产生多种毒性介质如氧自由基、蛋白酶和细胞因子，尤其是肿瘤坏死因子(TNF)对肝细胞造成损伤，甚至衰竭。这是严重创伤或感染后全身性炎症反应综合征所致多器官功能衰竭的一种具体表现［1］。但是目前有关枯否细胞(KC)、TNF在肝细胞损伤中的作用机制还存在争议。作者从细胞凋亡的角度着重研究了KC在诱导肝细胞损伤中的作用机制。
材料与方法
一、材料
肝细胞、枯否细胞的分离培养：采用原位灌注酶消化 法。首先分离出总的肝脏细胞，然后采用不同离心速度最终将肝细胞、枯否细胞等分开。细胞培养于RPMI1640(含10%小牛血清、青霉素100 U/ml，链霉素100 μg/ml，胰岛素0.1 U/ml以及Hepes 15 mmol)。培养条件37℃，5% CO2。
二、方法
1.KC凋亡诱导：调整KC成1×106/ml，接种于24孔培养板，培养4小时后换液，加入大肠杆菌001B4内毒素(0～10 μg/ml)培养1、3、6、12、24小时，取细胞做凋亡测试。
2.活化KC诱导肝细胞凋亡：KC受内毒素刺激24小时后，用无菌Hank′s液以培养板上洗脱下来，计数后加到肝细胞培养孔中(比例为1∶1)。联合培养1、3、6、12、24小时后做凋亡测试。
3.实验分组：(1) 正常KC组：1×106/ml细胞单独培养。(2) 正常HC组：1×106/ml细胞单独培养。(3) KC凋零诱导组：每孔加入0、0.1、1.0、10 μg/ml内毒素。(4) 肝细胞凋亡诱导组：肝细胞、KC细胞分别为1×106/ml(终浓度)。(5) 肝细胞内毒素处理组：分别加入内毒素0、1、10 μg/ml。(6) 拮抗组：KC及肝细胞联合培养分别加入0.1 μg TNF单抗/孔(终浓度)。
4.测量指标：(1) 凋亡：采用德国宝灵曼公司提供的体外细胞凋零检验试剂盒，ELISA方法，参照说明书进行。
2.TNF：取培养液上清，ELISA法测定，试剂盒由军科院提供。(3) 丙氨酸基转移酶(ALT)乳酸脱氢酶(LDH)测定：取培养上清液测定，试剂盒由上海长征医院科学有限公司提供。
三、统计学分析
所获数据均由华西医科大学提供的医学统计程序包行t检验和χ2检验。
结果
1.内毒素，TNF单抗对KC和HC凋亡的影响：在肝细胞凋亡组，当内毒素浓度大于1 μg/ml时肝细胞凋亡数迅速增加，达到32%±6%(P<0.05)。在正常KC组，正常肝细胞组，肝细胞内毒素处理组的细胞凋亡数分别是11%±3%，7%±2%以及8%±2%并无明显差别。但是加入TNF-α单克隆抗体后肝细胞，KC凋亡数均较凋亡诱导组有了显著下降(附表)。
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