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肿瘤坏死因子α对脐静脉血管内皮细胞增殖和细胞内游离钙浓度的影响

and it was dose-dependent. [Ca2+]i increased significantly and dose-dependent as well. Conclusion TNF-α may injure endothelium directly and inhibit its proliferation and repair through the changes of [Ca2+]i level. It may play an important role in the pathogenesis of PIH.
  【Key words】 Tumor necrosis factor;  Endothelium, vascular;  Cell division; Calcium

  近年来的研究表明,广泛的血管内皮损伤及功能障碍是妊娠高血压综合征(妊高征)发病的中心环节。妊高征时细胞因子包括肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量增多,TNF-α对血管内皮细胞具有损伤和激活作用[1,2]。本研究通过观察TNF-α对培养的人脐静脉血管内皮细胞增殖变化和细胞内游离钙浓度的影响,从细胞间信息传递水平探讨妊高征的发病机理。

材料与方法

  一、人脐静脉血管内皮细胞的培养处理及分组
  取正常分娩的新鲜脐带,按文献[3]方法稍加改进,接种细胞密度为1×104/cm2,当细胞融合成单层后,进行无血清培养24 h,然后添加:(1)TNF-α组:分别加入终浓度为500、1 000、2 000 U/ml的TNF-α(中国军事医学科学院提供);(2)对照组:培养液中不加TNF-α,以等量的0.01 mol/L、pH 7.4的磷酸盐缓冲生理盐水为替代。两组经培养处理的脐血管内皮细胞均继续置于37℃、5%的CO2孵箱中无血清培养24 h后测定。
  二、测定方法
  1. 流式细胞仪测定内皮细胞周期:收集内皮细胞,制备细胞数为1×106个/ml的细胞悬液,喷入4℃ 70%酒精中,4℃固定18 h后加入RNA酶(每样品中加入3 000活性单位,美国Sigma公司产品)37℃孵育0.5 h,然后放入冰水中终止RNA酶反应,用磷酸盐缓冲生理盐水制成1×106个/ml细胞悬液,加入碘化丙锭(美国Sigma公司产品)至终浓度为20 μg/ml进行DNA染色,期间样品需4℃避光处理,30 min后上机检测,按DNA含量作直方图,根据曲线下面积计算处于各细胞周期的细胞百分数。
  2.荧光分光光度法测定细胞内游离钙浓度:收集内皮细胞,制备细胞数为1×106个/ml的细胞悬液,检查细胞存活率在95%以上。加入荧光指示剂2-[6-双乙酸氨基-5-(2-双乙酸氨基)-5-甲苯氧乙氧基]-2苯丙呋喃基-5-恶唑羟酸的乙酰羟甲基酯(美国 Sigma公司产品)使终浓度为10 μmol/L,于37℃恒温震荡水浴中孵育30 min,磷酸盐缓冲生理盐水冲洗2次,重新调整细胞数至1×106个/ml,将细胞悬液吸入有搅拌装置的石英杯中,用荧光分光光度计(日立F-2000)测定细胞内游离钙浓度,发射波长为510 nm,双激发波长为380~340 nm,测定细胞负载前自身荧光强度和负载后的荧光强度,然后加入0.1%曲拉通X-100(美国Sigma公司产品)15 μl,测定其最大荧光强度,加入1 ml乙二胺四乙酸测定其最小荧光强度[4]。
  三、统计学处理
  所测数据以±s和平均数的百分比表示,组内和组间差异显著性检验采用配对t检验和χ2检验及方差分析。

结果

  一、TNF-α对脐静脉血管内皮细胞形态学变化的影响
  显微镜下观察发现,经TNF-α作用后内皮细胞被拉长,由原来的上皮型变为成纤维细胞型,细胞及核边界尚清楚、形态较规则,但在2 000 U/ml浓度时,可见有细胞脱落、细胞内异常颗粒出现。

上一页  [1] [2] 


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